(Under translation, sorry)
 The antibody (immunoglobulin), which plays a central role in higher animal's acquired immune system, has the ability to recognize, and to exclude various molecules to defend the self from the attack of foreign enemies (antigens) with high affinity and specificity. With the advent of the monoclonal antibody technology developed by Köhler and Milstein about 30 years ago, and the developments in recent recombinant antibody technologies including phage display technology, antibodies have been extensively used as a basic research reagent for the identification and purification of various molecules, and as a diagnostic reagent in hospitals as well as in diagnostic stations. Moreover, the rise of recombinant human antibodies that are in use as “killer” medicines of various refractory diseases results in the first ever pace of antibody usage in history.

 As for diagnostic purposes, usual protein antigens are measured by “sandwich” method, which uses two kinds of antibodies. サンドイッチ法は、抗原に同時に結合できる2種類の抗体を用意する必要があるが、その高い特異性と感度から好んで使われている。
A usual protein antigen is measured by the method of using two kinds of antibodies that are called a sandwich method in case of now almost. It is willingly used from the high uniqueness and sensitivity though the sandwich technique should prepare two kinds of antibodies that can be united with the antigen at the same time. しかし、分子量1,000以下の小分子は小さすぎて二種類の抗体でサンドイッチすることができない。言い方を変えれば抗原性決定基が一つしかない単価抗原であるためで、そのため小分子は通常競合法と呼ばれる方法で測定される。しかし競合法は、条件設定が難しく、感度が出にくい、測定操作にかなりの注意深さが必要、といった難点も持っている。
The sandwich is too small so that molecular weight may be done and the small molecule of 1,000 or less may do by two kinds of antibodies however. It is because it is a unit price antigen with only one antigenicity decision radical, and, therefore, the small molecule is measured if it alters one's phraseology by the method of the usual calling the competition technique. However, the competition technique is difficult the condition setting, and has the difficult point of necessity in the measurement operation of which sensitivity doesn't go out easily carefully considerably.
 このような欠点のない、小分子でも非競合的に測定できる方法として、我々は近年以下に示す「オープンサンドイッチ法(OS)」という免疫測定法を考案した (Fig. 1)Recently, we designed the following immunoassay methods "Open sandwich method (OS method)" as such a faultless method that was able to be measured also with the small molecule non-competitively (Fig. 1).

OPENSAN

Fig. 1 Open-sandwich ELISA

 This method is based on a phenomenon that ”Antibody variable region (antigen binding site, Fv) is not stable without antigen but is significantly stabilized when it binds to antigen”. Antibodies consist of pairs of H and L chains. The antigen-binding site of an antibody also consists of two variable region fragments called VH and VL, which is the smallest unit that can recognize antigens, which is also called Fv. それぞれの抗原結合部位は VH, VLと呼ばれこれらが抗原を認識できる最小単位である可変領域Fvを構成する。最近ではファージ提示法などを用いて容易にVHVLをコードする遺伝子断片をクローニングすることができるが、VHVLの間の結合は非共有的で多くの場合不安定であり、これらをペプチドで結んで一本鎖抗体(scFv)として使われる場合がほとんどである。我々はこの不安定な Fvが、抗原が結合すると安定化する場合があり、それを利用すれば抗原濃度を従来より簡便かつ迅速に、さらに感度よく測定できることを見い出した。すなわち上の図の様にVL断片をプレートに固定化しておき、これにVH断片にファージあるいはアルカリフォスファターゼを結合させたものと抗原(この場合鶏卵白リゾチーム)を含むサンプルとを混ぜて一回洗浄した後にプレートに固定化されたファージあるいは酵素の量を測定すれば、これが抗原量と非常によい相関を示すことを見いだした [1]

 この原理を利用すると、サンドイッチ法では2回必要なサンプルとの反応が3者複合体が安定なため1回ですむほか、例えば下図の様にVH断片とVL断片を別々の蛍光色素でラベルすると、両者が近付いたことを蛍光スペクトル変化として溶液中で検出することができる(蛍光共鳴エネルギー移動現象,Fig. 2)。この方法だと、抗原とのインキュベーション後1〜2分で抗原濃度を洗浄操作なしに決定できる。

OSFRET

Fig. 2 Open Sandwich FIA

 また、両断片間の相互作用を酵素の活性相補を利用して高感度に測定することで平衡解離定数 Kd値の1/1000近い濃度の小分子ハプテン測定がホモジニアス系で可能なことも示されている [2]。競合法では理論的にKd値の1/100が検出限界と言われているので、OS法の非競合法ならではの特徴が発揮されたと言えるであろう。

 さらに最近、我々は手持ちの抗体がOS法に向いているか向いていないかが、手軽に調べられる方法を開発した [3-5]。市販のファージ抗体システムに良く似たこの方法(split Fvシステム)を用いれば、手持ちのハイブリドーマの抗体可変領域の抗原結合能とVH/VL相互作用の強弱の両方を、ファージを作る大腸菌を変えることで手軽に調べることができ、またより良い性質の抗体の選択ができる。条件検討が今までより飛躍的に簡単になり、すでに環境ホルモン様作用が疑われるBisphenol A認識抗体をはじめとする多数の小分子抗体で、OS法に適した抗体のスクリーニングに成功している。

 ほとんどの低分子認識抗体はVH/VL両者の界面からなるポケットで抗原を認識していることが知られている。そのため低分子に対して高い親和性を持つFvは抗原結合によりVH/VL/抗原複合体が安定化すると考えられ,実際そのような報告も多い。もしそうであれば低分子の高感度な検出原理として,本法の適用範囲は極めて広いであろう。競合法に比べ高感度で幅広い濃度範囲の測定が可能な本法が,多くの抗原抗体系でより手軽に実施できるよう,現在更なる技術開発を進めている。

References

[1] Ueda, H. et al. Nature Biotechnol. 14, 1714-1718(1996)

[2] Ueda, H.
J. Biosci. Bioeng. 94(6), 614-619 (2002)

[3] Aburatani, T. et al.,
Anal. Chem. 75, 4057-4064 (2003)

[4] Ueda, H. "Noncompetitive immunoassays for small molecules".
Seikagaku, 76(7), 670-674 (2004)

[5] Ueda, H. “Sensitive noncompetitive measurement of small molecules
by Open sandwich immunoassay”
Yakugaku Zasshi 127(1) 71-80 (2007)

[6] Dong., J.H. et al.,
Anal. Biochem. 386, 36-44 (2009)

[7] Islam, K.N. et al.,
Anal. Chem. 83, in press (2011)

[8] Sasajima Y. et al.,
Biotechnol. Prog. 22, 968-973 (2006)

[9] Suzuki T. et al.,
Anal. Sci. 23, 65-70 (2007)

[10] Lim, S-.L., et al.,
Anal. Chem.,79(16), 6193-6200 (2007);
  Ihara, M. et al., Lab. Chip. 10, 92-100 (2010)

[11] Ihara, M. Suzuki, T. et al.,
Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009)